Аннотация
Проведение данного исследования является обязательным этапом изучения мефедрона как вещества, являющимся одним из самых популярных среди множества различных рекреационных психоактивных веществ. Поступление мефедрона в ткани-мишени и его концентрация в них зависит не только от введенной дозы, но и от множества других факторов – особенности распределения вещества, степени и скорости всасывания, пути метаболизма и экскреции. При введении внутрь важное значение приобретает определение доли введенного препарата, поступающей в ткани-мишени или биологические жидкости, с которым он в эти ткани транспортируется, при этом, выясняется какая часть участвует в биотрансформации, а какая попадает в системный кровоток неизменно. Также, на этапе доклинических исследований помимо изучения основного эффекта существует необходимость проведения широкого фенотипического скриннинга, который необходим для углубленного понимания фармакодинамики и побочных эффектов вещества. Одних из важных аспектов такого скриннинга является исследование психотропной активности вещества.
Цель исследования:
Первый этап: определение когнитивных мотивационных и поведенческих паттернов у крыс на фоне употребления 4-метилметкатинона.
Второй этап: Изучить эндотелиальную функцию посредством проведения сосудистых фармакологических проб с помощью блокады синтеза NO под контролем ультразвукового метода исследования скорости кровотока в бедренной артерии крысы и мониторингом общей гемодинамики и скорости микроциркуляции в медиальной мышце с помощью лазерной доплерофлоуметрии.
Третий этап: Выявление и оценка провоспалительной и иммунорегуляторной активности 4-метилметкатинона с использованием модели формалинового отека и НСТ-теста.
Материалы и методы:
Исследование проводилось на 40 крысах-самцах линии Wistar, массой 180-200 г. Животные были разделены на 4 группы: 1) Контрольная группа (интактные); 2) Крысы, которым внутрибрюшинно вводился мефедрон (каждые 48 часов) в дозировке 5 мг/кг разведенный в растворе NaCl 0,9% (0,5 мл.). 3) Крысы, которым перорально (посредством зонда) вводился мефедрон (каждые 48 часов) в дозировке 5 мг/кг разведенный в растворе NaCl 0,9% (0,5 мл). 4) Крысы, которым внутрибрюшинно вводился мефедрон (каждые 48 часов) в дозировке 5 мг/кг разведенный в растворе NaCl 0,9% (0,5 мл.) до введения формалина и моделирования формалинового отека.
Первый этап
Определение когнитивных мотивационных и поведенческих паттернов у крыс на фоне употребления 4-метилметкатинона. Для достижения поставленной цели были сформулированы следующие задачи: оценить влияние 4-метилметкатинона на уровень возбудимости, тревожности и устойчивости к стрессу. Для определения психоэмоционального состояния исследуемых животных мы использовали модернизированный протокол теста Холла, который заключается в помещении объекта в стандартизированную арену и регистрации показателей активности посредством программно-аппаратного комплекса PANLAB Harvard Apparatus SMART 3.0. В качестве оценочных единиц выбраны дискретные поведенческие акты, регистрируемые с помощью программно-аппаратного комплекса.
Работа была выполнена на 30 крысах (1, 2 и 3 группы соответственно). До эксперимента животные содержались в лабораторном виварии по 10 особей в клетке, с необращенным 12-часовым режимом, при температуре помещения 22-24 °C и влажности 60% на стандартной диете. Эксперименты проводили в летний период. Полученные результаты были проверены на нормальность распределения с помощью критерия Шапиро-Уилка и обработаны методами вариационной статистики с применением t-критерия Стьюдента посредством пакета компьютерных программ STATISTICA 10.0. На рисунке схематически представлен дизайн эксперимента.
Для оценки ориентировочно-исследовательского поведения регистрировали горизонтальную активность (количество вертикальных стоек), реакцию груминга (число проявлений и продолжительность), исследовательскую активность, локомоция (число заглядываний в норки), уринацию и дефекацию (по количеству болюсов). Эксперимент проводили в затемненном, ограниченном от поступления посторонних шумов и солнечного света помещении с 10 до 14 часов. Открытое поле представляло собой квадратную площадку размеров 150х150 см. с бортиками высотой 30 см. Температура в комнате поддерживалась на уровне 23 градусов по Цельсию. После каждого животного для дезодорации выполнялась санитарная обработка открытого поля. Перед исследованием каждой группы на открытое поле пускали нулевое животное (чтобы первое животное попадало в условия такого же феромонового пейзажа, как и остальные).
Второй этап
На 21 сутки крысы выводились из эксперимента. После анестезии крыс (Sol.Chloralhydrate 150 mg\kg + Zoletil 60 mg\kg), на фиксированной платформе, производилось изолированное выделение правой сонной артерии, обнажалась медиальная мышца бедра, катетеризировалась левая бедренная вена (для ввода идентифицирующих растворов). Многокомпонентное исследование гемодинамических параметров исследовалось методом специализированных нагрузочных проб с введением в бедренный катетер ацетилхолина и нитропруссида натрия (NO). Регистрация параметров (систолическое артериальное давление, диастолическое артериальное давление, частота сердечных сокращений) производилась с помощью датчика TDS-142 (Biopac system., программное обеспечение AcqKnowledge 4.2); концевой чувствительный датчик был подключен к катетеру, который находился непосредственной в правой сонной артерии. Скорость кровотока в левой бедренной артерии измеряли с помощью датчика УЗОП-010 с рабочей частотой 25 МГц Minimax-Doppler-K. Датчик был установлен над средней третью правой бедренной артерии и регистрировались следующие показатели: максимальная систолическая (Vs) и диастолическая (Vd) скорость, средняя (Qas) и объемная (Qam) скорость кровотока, индекс пульсации (Pl, индекс Гослинга) и индекс удельного сопротивления (RI, индекс Pourcelot). Для измерения скорости форменных элементов кровотока в сосудах микроциркуляторного русла использовался игловидный зонд-датчик (TDS-144, Biopac system.). Данный датчик был помещен в нижнюю треть медиальной широкой мышцы бедра. Вазоактивные агенты (ацетилхолин – 40 мкг/кг, нитропруссид натрия – 30 мкг/кг) вводились через катетер, установленный в левую бедренную вену, последовательно с интервалом 15 минут. Таким образом, была возможность параллельного мониторинга параметров гемодинамики и микроциркуляции в трехуровневой системе (центральное кровообращение – система эластических сосудов – система периферийный сосудов). Статистическая обработка результатов выполнена с помощью программного обеспечения STATISTICA 10 и MS Excel 2013. Затем проводили расчёт коэффициента эндотелиальной дисфункции (КЭД), являющийся отношением площади треугольника над кривой восстановления АД в ответ на введение НП (NO) к площади треугольника над кривой восстановления АД в ответ на введение АХ Статистический анализ проведен с использованием рангового теста Спирмена, расчет достоверности между группами произведен с использованием параметрического t-критерия Стьюдента.
Третий этап
Целью данного этапа исследования являлось изучение провоспалительных фармакологических свойств 4-метилметкатинона, а также степени воздействия на иммунную систему. Провоспалительную активность оценивали на модели «формалинового отека задней лапы», который вызывали субплантарным введением 0,1 мл. 2% раствора формалина. Оценка выраженности отека производилась посредством измерения толщины задней лапы с помощью электронного штангенциркуля Matrix 31611 до и через 2, 4, 6 часов, а также в динамике через 24 и 48 часов после введения раствора формалина. Провоспалительную активность исследуемого вещества выражали в процентах угнетения отека. Иммунный статус определяли посредством исследования показателей метаболической и поглотительной активности нейтрофилов с помощью НСТ-теста (тест восстановления нитросинего тетразолия), а также спонтанного и индуцированного фагоцитоза. Результаты эксперимента подверглись статистической обработке с применением пакета программ STATISTICA 10.0 и MS Excel 2013. Для оценки достоверности различий выборок с нормальным распределением применяли параметрический t-критерий Стьюдента. За достоверное принимали различие при уровне вероятности 95% и более (p<0,05).
Результаты первого этапа эксперимента
Диаграмма 1. Изменения показателей горизонтальной двигательной активности.
Диаграмма 2. Изменения показателей груминга.
Диаграмма 3. Изменение показателей дефекации и уринации.
Из представленных диаграмм видно, что влияние мефедрона на поведение животных соответствует его основным эффектам, обусловленных известным механизмом его действия. Так, диаграмма 1 иллюстрирует значительное повышение горизонтальной двигательной активности по сравнению с контрольной группой. На диаграмме 2 видно, что акты груминга значительно снижены, данное явление обуславливается уменьшением мотивационного влияния относительно настоящей необходимости. Диаграмма 3 отчетливо визуализирует увеличение актов дефекации и уринации, что является одним из частых проявлений употребления 4mmс.
Схема 1. Алгоритм интерпретации данных.
На схеме 1 представлен алгоритм, составленный для интерпретации полученных данных. Известно, что большинство анализируемых в открытом поле поведенческих актов не могут быть трактованы однозначно и важна их совокупная оценка. Так, повышение горизонтальной активности может свидетельствовать об анксиолитическом, анксиогенном, ажитационном действии или повышении двигательной активности без эмоционального компонента (моторное возбуждение). Реакции груминга также могут быть трактованы неоднозначно, поскольку частота актов ухода о себе увеличивается как в стрессовой, так и в благоприятной обстановке. Наиболее просто могут быть истолкованы проявления исследовательской активности, а также частота уринаций и дефекаций. Пользуясь данным алгоритмом заключено, что фармакодинамический эффект 4mmc в отношении высшей нервной деятельности может быть трактован как моторное возбуждение с эмоциональным компонентом.
Результаты второго этапа эксперимента
Контрольная группа демонстрировала однотипные ответы на введение АХ и NO, которые проявлялись падением систолического, диастолического и среднего артериального давления, снижением линейной скорости микроциркуляции, а также диастолической скорости движения крови в бедренной артерии (далее БА), (показатели данных - Vd, Vad); 2) увеличением систолической скорости движения крови в БА (Vs, Vas), индексов Пурселло и Гослинга (Рисунок 2). Параметры возвращались в исходные значения в течение 2 минут.
Рисунок 2. Кривые показателей исследуемых данных.
Рисунок 3. Скриншот интерфейса программы в момент регистрации параметров.
Дальнейшая статистическая обработка проводилась при определении ряда значений во времени по каждой пробе, которые выражались в процентном значении, где исходное значение принято за 100% по формуле – Значение/Исходное значение x 100%.
Критерий Спирмана, с помощью которого проводился статистический анализ, показал наилучшее выражение необходимой разницы статистически важных параметров. Наибольшая степень корреляции (p<0,05) определялась между показателем среднего артериального давления (далее СрАД), линейной скорости микроциркуляции, систолической скорости и систоло-диастолической разницы скоростей в бедренной артерии. Другие сонографические параметры продемонстрировали низкую и менее достоверную корреляцию с динамикой АД и скорости микроциркуляции.
Таблица 1. Показатели КЭД и АД при 4-mmc-индуцированном дефиците NO у крыс-самцов
Исследование 4-mmc при пероральном введении выявило статистически значимое повышение показателей САД, ДАД и коэффициента эндотелиальной дисфункции (КЭД) в сравнении с контрольной группой. Показатели максимальной систолической (Vs) и максимальной диастолической скорости (Vd) значительно снижаются при проведении нагрузочных проб у крыс, принадлежащих группе 3, которой перорально вводился мефедрон согласно указанному алгоритму (Рисунок 2).
Рисунок 4. Расположение датчиков на исследуемом объекте.
Эффективность эндотелий-зависимых релаксационных факторов, высвобождающихся и активирующихся при введении ацетилхолина, количественно и качественно снижается, а NO-опосредуемый эффект в ответ на проведение нагрузочной АХ-пробы уменьшается, что обусловлено отрицательным влиянием 4-mmc на продукцию и экспрессию как данного фактора, так и активность гуанилатциклазы. АХ-индуцируемая эндотелий-зависимая релаксация сосудов микроциркуляторного русла, опосредуемая через мускариновые рецепторы, также нарушается, вследствие дегенерации активности рецепторного аппарата, а также
снижения плотности рецепторов на поверхности соответствующих эндотелиоцитах. Вероятно, механизм снижения АХ-опосредованной эндотелий-зависимой реакции на фоне употребления 4-mmc обусловлен значительным увеличением образования свободных радикалов (как супероксидных так и гидроксильных) при гипоксическом состоянии клетки, которые, в свою очередь, взаимодействуют с NO2и NO3.
Результаты третьего этапа эксперимента. Часть 1. Исследование провоспалительной активности мефедрона на модели «Формалиновый отек».
При проведении исследования, вовремя субплантарного введения 2% раствора формалина в объеме 1 мл. развивался выраженный отек лапы, о чем свидетельствует визуальное увеличение объема. Максимальный отек развивался через 4 часа после введения. Отек лапы у интактных животных увеличивался в среднем на 32% (при p<0,05). У группы 4 отек лапы увеличивался в среднем на 51%, что свидетельствует о продолжительном системном воспалительном процессе, обуславливающим данные статистические показатели.
Таблица 2. Показатели динамики продолжительности отека и его величин
На таблице 2 представлены показатели объема лапки на каждом периоде от начала моделирования отека. Определяется значительное увеличение как объема, так и продолжительности отека в группе 4 (мефедрон), относительно показателей интактных животных.
Продолжительность альтеративных и экссудативных этапов, как составляющих периоды воспаления, наиболее демонстративно визуализируется на диаграмме 3. Голубая линяя – диаграмма показателей группы 4 (мефедрон), зеленая линия – диаграмма показателей интактной группы.
Диаграмма 3. Показатели динамики продолжительности отека и его величин.
Результаты третьего этапа эксперимента. Часть 2. Определение иммунного статуса посредством НСТ-теста.
Алгоритм исследования метаболической активности нейтрофилов в крови методом НСТ-теста включает в себя следующие этапы:
1. Забор крови у исследуемого животного в пробирку (3 мл.).
2. Отстаивание крови в течение 40-50 минут при комнатной температуре до появления надосадочной плазмы.
3. Отсасывание плазмы в стерильную пробирку и центрифугирование содержимого пробирки в течение 10 минут при 500 об.\мин. со сливом надосадочной жидкости.
4. Добавление в пробирку с плазмой 0,05 мл. 0,1% раствора нитросинего тетразолия *спонтанный НСТ-тест.
5. Добавление 0,05 мл. суспензии латекса с размером частиц 1 мкм *индуцированный НСТ-тест и инкубация в течение 40 минут при t=37 °C.
6. Перенос клеток на предметное стекло и фиксация препарата раствором этанола.
7. Окрашивание препарата раствором Азур-Эозином.
8. Микроскопическое исследование мазка при увеличении 90х10 под иммерсией.
Результаты исследования оценивают по наличию формазан-позитивных клеток, что свидетельствует о метаболической активности фагоцитов.
При проведении настоящего этапа исследования определено статистически значимое снижение метаболической активности нейтрофилов на 38,4% (Me = 13,1 с интерквартильным размахом от 10,3 до 15,9 с разницей в 5,3 при p=0,002; z = 3,008) по сравнению с показателями контрольной группы. При исследовании поглотительной способности посредством фагоцитоза с добавлением латекса, показатели увеличивались с 13,1 Me до 16,5 Me, с процентом прироста 18,2% для группы 3 (внутрибрюшное введение 4-mmc), однако, процентная разница относительно контрольной группы составляет 18,0%, что является значительным и статистически достоверным доказательством имунносупрессивного действия 4-mmc.
Также, было установлено статистически значимое уменьшение спонтанного фагоцитоза исследуемых животных группы 3 с уменьшением на 25,3% (при p>0,0001, z=2,84) относительно интактных животных.
Таблица 3. Показатели метаболической и поглотительной активности нейтрофилов.
Обсуждение и выводы
1. При введении мефедрона экспериментальным животным было зарегистрировано статистически достоверное изменение анализируемых поведенческих актов, что указывает на присутствие у данного соединения специфической психотропной активности с чрезмерно повышенными уровнями возбудимости и тревожности, однако, со сниженной устойчивости к стрессу. Таким образом, результаты данного этапа исследования расширили сведения о профиле действия изучаемого соединения. Наблюдаемые психотропные эффекты 4-mmc углубляют представления о спектре его фармакологической активности и должны служить предметом дальнейшего изучения.
2. Стойкое повышенное параметров АД в исходных состояниях у крыс группы 3 (мефедрон), а также их относительные показатели после проведения нагрузочных проб, обуславливается нарушением не только экспрессии NO (один из основных вазодилатирующих факторов, регулирующих работу сосудов микроциркуляторного русла), но и простациклинов и гиперполяризационных факторов эндотелия (EDHF). Результаты настоящего этапа исследования подтверждают теоретическое предположение о чрезмерном отрицательном влиянии 4-mmc как на эндотелий сосудов микроциркуляторного русла, так и на состоятельность работы сердечно-сосудистой системы в целом. Полученные данные могут быть использованы в планировании доклинических исследований по расширению спектра терапевтических осложнений на фоне употребления 4-mmc, а также для построения алгоритма клинических рекомендаций для фармакологической коррекции осложненных состояний, связанных с употреблением 4-mmc.
3.1. Учитывая, что мефедрон, вероятно, снижает перфузионную проницаемость клеточной стенки и транспортную функцию белков, влияя как на пассивную и облегченную диффузию, так и на активный транспорт, определенно влияет на когнитивные паттерны (в том числе и отсроченные явления), а также, обладает способностью влиять на коагуляционный компонент гемостаза положительно (гиперкоагуляция), можно предположить о преобладании активности ЦОГ-2 как основного энзима, играющего роль в процессе индукции альтеративной фазы воспаления. Таким образом, применение селективных ингибиторов ЦОГ-2 при воспалительных заболеваниях различной этиологии на фоне употребления 4-mmc является наиболее предпочтительным и обоснованным. Однако, для однозначного определения фармакологической терапии, направленной на купирование процессов воспаления, связанных с употреблением мефедрона, необходимо проведение дополнительных доклинических исследований.
3.2. Результаты проведенной части третьего этапа исследования доказали снижение метаболической и поглотительной активности нейтрофилов у крыс, принадлежащих группе 3 (внутрибрюшное введение 4-mmc), относительно показателей животных контрольной группы, что определяет 4-метилметкатинон как вещество, оказывающее иммуносупрессивное действие на организм. Данное заключение является основанием для проведения дальнейших исследований патогенетической корригирующей иммунотерапии.
Проведение данного исследования является обязательным этапом изучения мефедрона как вещества, являющимся одним из самых популярных среди множества различных рекреационных психоактивных веществ. Поступление мефедрона в ткани-мишени и его концентрация в них зависит не только от введенной дозы, но и от множества других факторов – особенности распределения вещества, степени и скорости всасывания, пути метаболизма и экскреции. При введении внутрь важное значение приобретает определение доли введенного препарата, поступающей в ткани-мишени или биологические жидкости, с которым он в эти ткани транспортируется, при этом, выясняется какая часть участвует в биотрансформации, а какая попадает в системный кровоток неизменно. Также, на этапе доклинических исследований помимо изучения основного эффекта существует необходимость проведения широкого фенотипического скриннинга, который необходим для углубленного понимания фармакодинамики и побочных эффектов вещества. Одних из важных аспектов такого скриннинга является исследование психотропной активности вещества.
Цель исследования:
Первый этап: определение когнитивных мотивационных и поведенческих паттернов у крыс на фоне употребления 4-метилметкатинона.
Второй этап: Изучить эндотелиальную функцию посредством проведения сосудистых фармакологических проб с помощью блокады синтеза NO под контролем ультразвукового метода исследования скорости кровотока в бедренной артерии крысы и мониторингом общей гемодинамики и скорости микроциркуляции в медиальной мышце с помощью лазерной доплерофлоуметрии.
Третий этап: Выявление и оценка провоспалительной и иммунорегуляторной активности 4-метилметкатинона с использованием модели формалинового отека и НСТ-теста.
Материалы и методы:
Исследование проводилось на 40 крысах-самцах линии Wistar, массой 180-200 г. Животные были разделены на 4 группы: 1) Контрольная группа (интактные); 2) Крысы, которым внутрибрюшинно вводился мефедрон (каждые 48 часов) в дозировке 5 мг/кг разведенный в растворе NaCl 0,9% (0,5 мл.). 3) Крысы, которым перорально (посредством зонда) вводился мефедрон (каждые 48 часов) в дозировке 5 мг/кг разведенный в растворе NaCl 0,9% (0,5 мл). 4) Крысы, которым внутрибрюшинно вводился мефедрон (каждые 48 часов) в дозировке 5 мг/кг разведенный в растворе NaCl 0,9% (0,5 мл.) до введения формалина и моделирования формалинового отека.
Первый этап
Определение когнитивных мотивационных и поведенческих паттернов у крыс на фоне употребления 4-метилметкатинона. Для достижения поставленной цели были сформулированы следующие задачи: оценить влияние 4-метилметкатинона на уровень возбудимости, тревожности и устойчивости к стрессу. Для определения психоэмоционального состояния исследуемых животных мы использовали модернизированный протокол теста Холла, который заключается в помещении объекта в стандартизированную арену и регистрации показателей активности посредством программно-аппаратного комплекса PANLAB Harvard Apparatus SMART 3.0. В качестве оценочных единиц выбраны дискретные поведенческие акты, регистрируемые с помощью программно-аппаратного комплекса.
Работа была выполнена на 30 крысах (1, 2 и 3 группы соответственно). До эксперимента животные содержались в лабораторном виварии по 10 особей в клетке, с необращенным 12-часовым режимом, при температуре помещения 22-24 °C и влажности 60% на стандартной диете. Эксперименты проводили в летний период. Полученные результаты были проверены на нормальность распределения с помощью критерия Шапиро-Уилка и обработаны методами вариационной статистики с применением t-критерия Стьюдента посредством пакета компьютерных программ STATISTICA 10.0. На рисунке схематически представлен дизайн эксперимента.
Для оценки ориентировочно-исследовательского поведения регистрировали горизонтальную активность (количество вертикальных стоек), реакцию груминга (число проявлений и продолжительность), исследовательскую активность, локомоция (число заглядываний в норки), уринацию и дефекацию (по количеству болюсов). Эксперимент проводили в затемненном, ограниченном от поступления посторонних шумов и солнечного света помещении с 10 до 14 часов. Открытое поле представляло собой квадратную площадку размеров 150х150 см. с бортиками высотой 30 см. Температура в комнате поддерживалась на уровне 23 градусов по Цельсию. После каждого животного для дезодорации выполнялась санитарная обработка открытого поля. Перед исследованием каждой группы на открытое поле пускали нулевое животное (чтобы первое животное попадало в условия такого же феромонового пейзажа, как и остальные).
Второй этап
На 21 сутки крысы выводились из эксперимента. После анестезии крыс (Sol.Chloralhydrate 150 mg\kg + Zoletil 60 mg\kg), на фиксированной платформе, производилось изолированное выделение правой сонной артерии, обнажалась медиальная мышца бедра, катетеризировалась левая бедренная вена (для ввода идентифицирующих растворов). Многокомпонентное исследование гемодинамических параметров исследовалось методом специализированных нагрузочных проб с введением в бедренный катетер ацетилхолина и нитропруссида натрия (NO). Регистрация параметров (систолическое артериальное давление, диастолическое артериальное давление, частота сердечных сокращений) производилась с помощью датчика TDS-142 (Biopac system., программное обеспечение AcqKnowledge 4.2); концевой чувствительный датчик был подключен к катетеру, который находился непосредственной в правой сонной артерии. Скорость кровотока в левой бедренной артерии измеряли с помощью датчика УЗОП-010 с рабочей частотой 25 МГц Minimax-Doppler-K. Датчик был установлен над средней третью правой бедренной артерии и регистрировались следующие показатели: максимальная систолическая (Vs) и диастолическая (Vd) скорость, средняя (Qas) и объемная (Qam) скорость кровотока, индекс пульсации (Pl, индекс Гослинга) и индекс удельного сопротивления (RI, индекс Pourcelot). Для измерения скорости форменных элементов кровотока в сосудах микроциркуляторного русла использовался игловидный зонд-датчик (TDS-144, Biopac system.). Данный датчик был помещен в нижнюю треть медиальной широкой мышцы бедра. Вазоактивные агенты (ацетилхолин – 40 мкг/кг, нитропруссид натрия – 30 мкг/кг) вводились через катетер, установленный в левую бедренную вену, последовательно с интервалом 15 минут. Таким образом, была возможность параллельного мониторинга параметров гемодинамики и микроциркуляции в трехуровневой системе (центральное кровообращение – система эластических сосудов – система периферийный сосудов). Статистическая обработка результатов выполнена с помощью программного обеспечения STATISTICA 10 и MS Excel 2013. Затем проводили расчёт коэффициента эндотелиальной дисфункции (КЭД), являющийся отношением площади треугольника над кривой восстановления АД в ответ на введение НП (NO) к площади треугольника над кривой восстановления АД в ответ на введение АХ Статистический анализ проведен с использованием рангового теста Спирмена, расчет достоверности между группами произведен с использованием параметрического t-критерия Стьюдента.
Третий этап
Целью данного этапа исследования являлось изучение провоспалительных фармакологических свойств 4-метилметкатинона, а также степени воздействия на иммунную систему. Провоспалительную активность оценивали на модели «формалинового отека задней лапы», который вызывали субплантарным введением 0,1 мл. 2% раствора формалина. Оценка выраженности отека производилась посредством измерения толщины задней лапы с помощью электронного штангенциркуля Matrix 31611 до и через 2, 4, 6 часов, а также в динамике через 24 и 48 часов после введения раствора формалина. Провоспалительную активность исследуемого вещества выражали в процентах угнетения отека. Иммунный статус определяли посредством исследования показателей метаболической и поглотительной активности нейтрофилов с помощью НСТ-теста (тест восстановления нитросинего тетразолия), а также спонтанного и индуцированного фагоцитоза. Результаты эксперимента подверглись статистической обработке с применением пакета программ STATISTICA 10.0 и MS Excel 2013. Для оценки достоверности различий выборок с нормальным распределением применяли параметрический t-критерий Стьюдента. За достоверное принимали различие при уровне вероятности 95% и более (p<0,05).
Результаты первого этапа эксперимента
Диаграмма 1. Изменения показателей горизонтальной двигательной активности.
Диаграмма 2. Изменения показателей груминга.
Диаграмма 3. Изменение показателей дефекации и уринации.
Из представленных диаграмм видно, что влияние мефедрона на поведение животных соответствует его основным эффектам, обусловленных известным механизмом его действия. Так, диаграмма 1 иллюстрирует значительное повышение горизонтальной двигательной активности по сравнению с контрольной группой. На диаграмме 2 видно, что акты груминга значительно снижены, данное явление обуславливается уменьшением мотивационного влияния относительно настоящей необходимости. Диаграмма 3 отчетливо визуализирует увеличение актов дефекации и уринации, что является одним из частых проявлений употребления 4mmс.
Схема 1. Алгоритм интерпретации данных.
На схеме 1 представлен алгоритм, составленный для интерпретации полученных данных. Известно, что большинство анализируемых в открытом поле поведенческих актов не могут быть трактованы однозначно и важна их совокупная оценка. Так, повышение горизонтальной активности может свидетельствовать об анксиолитическом, анксиогенном, ажитационном действии или повышении двигательной активности без эмоционального компонента (моторное возбуждение). Реакции груминга также могут быть трактованы неоднозначно, поскольку частота актов ухода о себе увеличивается как в стрессовой, так и в благоприятной обстановке. Наиболее просто могут быть истолкованы проявления исследовательской активности, а также частота уринаций и дефекаций. Пользуясь данным алгоритмом заключено, что фармакодинамический эффект 4mmc в отношении высшей нервной деятельности может быть трактован как моторное возбуждение с эмоциональным компонентом.
Результаты второго этапа эксперимента
Контрольная группа демонстрировала однотипные ответы на введение АХ и NO, которые проявлялись падением систолического, диастолического и среднего артериального давления, снижением линейной скорости микроциркуляции, а также диастолической скорости движения крови в бедренной артерии (далее БА), (показатели данных - Vd, Vad); 2) увеличением систолической скорости движения крови в БА (Vs, Vas), индексов Пурселло и Гослинга (Рисунок 2). Параметры возвращались в исходные значения в течение 2 минут.
Рисунок 2. Кривые показателей исследуемых данных.
Рисунок 3. Скриншот интерфейса программы в момент регистрации параметров.
Дальнейшая статистическая обработка проводилась при определении ряда значений во времени по каждой пробе, которые выражались в процентном значении, где исходное значение принято за 100% по формуле – Значение/Исходное значение x 100%.
Критерий Спирмана, с помощью которого проводился статистический анализ, показал наилучшее выражение необходимой разницы статистически важных параметров. Наибольшая степень корреляции (p<0,05) определялась между показателем среднего артериального давления (далее СрАД), линейной скорости микроциркуляции, систолической скорости и систоло-диастолической разницы скоростей в бедренной артерии. Другие сонографические параметры продемонстрировали низкую и менее достоверную корреляцию с динамикой АД и скорости микроциркуляции.
Таблица 1. Показатели КЭД и АД при 4-mmc-индуцированном дефиците NO у крыс-самцов
Исследование 4-mmc при пероральном введении выявило статистически значимое повышение показателей САД, ДАД и коэффициента эндотелиальной дисфункции (КЭД) в сравнении с контрольной группой. Показатели максимальной систолической (Vs) и максимальной диастолической скорости (Vd) значительно снижаются при проведении нагрузочных проб у крыс, принадлежащих группе 3, которой перорально вводился мефедрон согласно указанному алгоритму (Рисунок 2).
Рисунок 4. Расположение датчиков на исследуемом объекте.
Эффективность эндотелий-зависимых релаксационных факторов, высвобождающихся и активирующихся при введении ацетилхолина, количественно и качественно снижается, а NO-опосредуемый эффект в ответ на проведение нагрузочной АХ-пробы уменьшается, что обусловлено отрицательным влиянием 4-mmc на продукцию и экспрессию как данного фактора, так и активность гуанилатциклазы. АХ-индуцируемая эндотелий-зависимая релаксация сосудов микроциркуляторного русла, опосредуемая через мускариновые рецепторы, также нарушается, вследствие дегенерации активности рецепторного аппарата, а также
снижения плотности рецепторов на поверхности соответствующих эндотелиоцитах. Вероятно, механизм снижения АХ-опосредованной эндотелий-зависимой реакции на фоне употребления 4-mmc обусловлен значительным увеличением образования свободных радикалов (как супероксидных так и гидроксильных) при гипоксическом состоянии клетки, которые, в свою очередь, взаимодействуют с NO2и NO3.
Результаты третьего этапа эксперимента. Часть 1. Исследование провоспалительной активности мефедрона на модели «Формалиновый отек».
При проведении исследования, вовремя субплантарного введения 2% раствора формалина в объеме 1 мл. развивался выраженный отек лапы, о чем свидетельствует визуальное увеличение объема. Максимальный отек развивался через 4 часа после введения. Отек лапы у интактных животных увеличивался в среднем на 32% (при p<0,05). У группы 4 отек лапы увеличивался в среднем на 51%, что свидетельствует о продолжительном системном воспалительном процессе, обуславливающим данные статистические показатели.
Таблица 2. Показатели динамики продолжительности отека и его величин
На таблице 2 представлены показатели объема лапки на каждом периоде от начала моделирования отека. Определяется значительное увеличение как объема, так и продолжительности отека в группе 4 (мефедрон), относительно показателей интактных животных.
Продолжительность альтеративных и экссудативных этапов, как составляющих периоды воспаления, наиболее демонстративно визуализируется на диаграмме 3. Голубая линяя – диаграмма показателей группы 4 (мефедрон), зеленая линия – диаграмма показателей интактной группы.
Диаграмма 3. Показатели динамики продолжительности отека и его величин.
Результаты третьего этапа эксперимента. Часть 2. Определение иммунного статуса посредством НСТ-теста.
Алгоритм исследования метаболической активности нейтрофилов в крови методом НСТ-теста включает в себя следующие этапы:
1. Забор крови у исследуемого животного в пробирку (3 мл.).
2. Отстаивание крови в течение 40-50 минут при комнатной температуре до появления надосадочной плазмы.
3. Отсасывание плазмы в стерильную пробирку и центрифугирование содержимого пробирки в течение 10 минут при 500 об.\мин. со сливом надосадочной жидкости.
4. Добавление в пробирку с плазмой 0,05 мл. 0,1% раствора нитросинего тетразолия *спонтанный НСТ-тест.
5. Добавление 0,05 мл. суспензии латекса с размером частиц 1 мкм *индуцированный НСТ-тест и инкубация в течение 40 минут при t=37 °C.
6. Перенос клеток на предметное стекло и фиксация препарата раствором этанола.
7. Окрашивание препарата раствором Азур-Эозином.
8. Микроскопическое исследование мазка при увеличении 90х10 под иммерсией.
Результаты исследования оценивают по наличию формазан-позитивных клеток, что свидетельствует о метаболической активности фагоцитов.
При проведении настоящего этапа исследования определено статистически значимое снижение метаболической активности нейтрофилов на 38,4% (Me = 13,1 с интерквартильным размахом от 10,3 до 15,9 с разницей в 5,3 при p=0,002; z = 3,008) по сравнению с показателями контрольной группы. При исследовании поглотительной способности посредством фагоцитоза с добавлением латекса, показатели увеличивались с 13,1 Me до 16,5 Me, с процентом прироста 18,2% для группы 3 (внутрибрюшное введение 4-mmc), однако, процентная разница относительно контрольной группы составляет 18,0%, что является значительным и статистически достоверным доказательством имунносупрессивного действия 4-mmc.
Также, было установлено статистически значимое уменьшение спонтанного фагоцитоза исследуемых животных группы 3 с уменьшением на 25,3% (при p>0,0001, z=2,84) относительно интактных животных.
Таблица 3. Показатели метаболической и поглотительной активности нейтрофилов.
Обсуждение и выводы
1. При введении мефедрона экспериментальным животным было зарегистрировано статистически достоверное изменение анализируемых поведенческих актов, что указывает на присутствие у данного соединения специфической психотропной активности с чрезмерно повышенными уровнями возбудимости и тревожности, однако, со сниженной устойчивости к стрессу. Таким образом, результаты данного этапа исследования расширили сведения о профиле действия изучаемого соединения. Наблюдаемые психотропные эффекты 4-mmc углубляют представления о спектре его фармакологической активности и должны служить предметом дальнейшего изучения.
2. Стойкое повышенное параметров АД в исходных состояниях у крыс группы 3 (мефедрон), а также их относительные показатели после проведения нагрузочных проб, обуславливается нарушением не только экспрессии NO (один из основных вазодилатирующих факторов, регулирующих работу сосудов микроциркуляторного русла), но и простациклинов и гиперполяризационных факторов эндотелия (EDHF). Результаты настоящего этапа исследования подтверждают теоретическое предположение о чрезмерном отрицательном влиянии 4-mmc как на эндотелий сосудов микроциркуляторного русла, так и на состоятельность работы сердечно-сосудистой системы в целом. Полученные данные могут быть использованы в планировании доклинических исследований по расширению спектра терапевтических осложнений на фоне употребления 4-mmc, а также для построения алгоритма клинических рекомендаций для фармакологической коррекции осложненных состояний, связанных с употреблением 4-mmc.
3.1. Учитывая, что мефедрон, вероятно, снижает перфузионную проницаемость клеточной стенки и транспортную функцию белков, влияя как на пассивную и облегченную диффузию, так и на активный транспорт, определенно влияет на когнитивные паттерны (в том числе и отсроченные явления), а также, обладает способностью влиять на коагуляционный компонент гемостаза положительно (гиперкоагуляция), можно предположить о преобладании активности ЦОГ-2 как основного энзима, играющего роль в процессе индукции альтеративной фазы воспаления. Таким образом, применение селективных ингибиторов ЦОГ-2 при воспалительных заболеваниях различной этиологии на фоне употребления 4-mmc является наиболее предпочтительным и обоснованным. Однако, для однозначного определения фармакологической терапии, направленной на купирование процессов воспаления, связанных с употреблением мефедрона, необходимо проведение дополнительных доклинических исследований.
3.2. Результаты проведенной части третьего этапа исследования доказали снижение метаболической и поглотительной активности нейтрофилов у крыс, принадлежащих группе 3 (внутрибрюшное введение 4-mmc), относительно показателей животных контрольной группы, что определяет 4-метилметкатинон как вещество, оказывающее иммуносупрессивное действие на организм. Данное заключение является основанием для проведения дальнейших исследований патогенетической корригирующей иммунотерапии.